Granzym B je enzym cytotoxických T - lymfocytů produkovaný spolu s perforiny do imunologické synapse. Perforiny jsou žádoucí, aby se zdárně dostal do cytoplazmy cílové buňky. Granzym B zde působí jako aktivátor apoptózy, k čemuž používá několik alternativních cest. Jednou z cest je využití kaspáz, jinak účastníků kaskády vázané na FAS receptor. Další možností je ovlivnění mitochondrií, tak aby uvolnily cytochorom c a další apoptózu indukující faktory. Konečným výsledkem je rychlá fragmentace DNA, v případě uvolnění cytochromu c i nekróza. Autoři: Ondřej Kudela, Miroslava Jarošíková, David Major, Jiří Náhlovský Úvod Cytotoxické T - lymfocyty (CTL) jsou buňky zodpovědné za likvidaci vlastních nádorově změněných či viry napadených buněk. Jejich cytotoxická činnost spočívá v indukci apoptózy a narušení membrány cílové buňky pomocí systému bílkovinných perforinů a specifických enzymů - granzymů. Granzym B je v současnosti považován za nejdůležitější enzym z této skupiny. Právě letošní udílení Nobelovy ceny za medicínu a fyziologii se odehrávalo ve znamení apoptózy, nezbytného jevu v procesech nejen embryologických a vývojových, ale i imunologických. V této oblasti se i nadále intenzivně bádá a nepochybně ještě zdaleka není konec všem překvapením. Granzym B v kostce Obr. 1: Mechanismus vniknutí granzymu B do buňky Granzym B je serinová proteáza, se specifitou pro známou sekvenci aminokyselin*, aktivující intracelulární enzymy cílové buňky, takzvané kaspázy (caspases), které jsou zodpovědné za fyziologickou apoptotickou kaskádu. Z celé rodiny granzymů je právě granzym B zodpovědný za tzv. rychlou fragmentaci DNA (rapid DNA fragmentation). Tato jeho schopnost byla odhalena dedukcí z faktu, že granzym B deficientní CTL mají výrazně sníženou schopnost způsobit v cílové buňce rychlou fragmentaci DNA, zatímco schopnost déle trvající fragmentace zůstává nedotčena. Uzlové body mechanismu účinků granzymu B jsou v zásadě dva - jednak je nutno zajistit jeho intracelulární přítomnost (pasáž přes membránu). To je nezbytnou podmínkou pro uzel druhý, aktivaci kaspázy štěpnou reakcí z jejího prekurzoru. Aktivace kaspázy může probíhat různými cestami, z nichž jedna zahrnuje i aktivní účast mitochondrií. Klasická cesta je spouštěna aktivací kaspázy 8, jejím alternativním obrazem je přímá aktivace kaspázy 3 a konečně, granzym B je schopen štěpit inaktivní formu BID proteinu, což za účasti mitochondrií aktivuje kaspázu 9. Nicméně je třeba si uvědomit, že indukce apoptózy v cílové buňce není jediným mechanismem cytotoxicity granzymu B, jehož další intracelulární účinky spočívají v poškozování DNA a nepřímému poškození cytoplazmy vedoucímu až k nekróze. Jak dovnitř? Za každou cenu! Původní názor popisující princip, jakým se granzym B dostává do buňky, se neukázal jako zcela úplný, protože internalizace granzymu B neprobíhá jen následovně popsaným způsobem, ale i jinak fungujícími mechanismy. Mělo se za to, že aktivitou speciálních proteinů, tzv. perforinů, které CTL produkuje do imunologické synapse, se vytvářejí v membráně cílové buňky póry, kterými granzym B proniká do vnitřního prostředí. Tyto takzvané polyperforinové membránově specifické póry (polyperforine plasma-membrane-specific pores) se tvoří vzájemnou vazbou několika perforinových jednotek. Pozdější výzkum ale odhalil, že granzym B naplňuje svoji funkci i při tak nízké koncentraci perforinů, že jejich množství není dostatečné k vytvoření pórů. To by nahrávalo možné skutečnosti, že je granzym endocytován samotnou cílovou buňkou. Při specificky cílených pokusech se zjistilo, že je proces transportu při nedostatku perforinů saturovatelný. Logickou konstrukcí se vyvozovala existence membránového receptoru, na nějž je endocytóza vázána. Před nedávnem byl tímto receptorem stanoven receptor pro manosa-6-fosfát. Po endocytóze ovšem granzym B stále není schopen naplňovat svoji funkci, pokud se nedostane přímo do cytosolu, tj. kompartmentu, pro který je funkčně určen. Čili jeho přítomnost uvnitř endosomů apoptózu ještě nevyvolává a tudíž je žádoucí usnadnit jeho migraci do cytosolu. Pro tento přechod je klíčový právě výše zmiňovaný perforin, ovšem již v koncentraci daleko nižší, než jaká je dostačující pro tvorbu pórů v cytoplazmatické membráně. Mnoho tváří smrti Obr. 2: Působení granzymu B na děje uvnitř buňky vedoucí k apoptóze Nyní již máme granzym šťastně uvnitř buňky a nic nebrání, aby mohl bez dalšího zdržování zahájit mechanismus, který mu náleží - spustit programovanou smrt buńky neboli apoptózu. To je možné různými cestami: Jakmile je granzym B přítomen v cytosolu, vykonává svoji funkci interakcí se svým přímým substrátem, neaktivní formou kaspázy-8 a enzymatickým pochodem ji aktivuje. To spustí kaskádu enzymatických dějů, která ústí ve fragmentaci DNA, tak typickou pro buňky v apoptóze. Granzym B de facto účinkuje na soubor dějů vedoucí k apoptóze, který však není specifická pouze pro granzym B, ale v jiných případech může být spuštěn aktivací FAS receptoru. Aktivovaná kaspáza-8 dále štěpí pro-kaspázu-3 za vzniku její aktivní formy, která působí na DFF40/CAD (DNA Fragmentation 40 / Caspase Activated Deoxynuclease) respektive na specifický inhibitor ICAD. Deinhibovaný DFF40/CAD poté vstupuje do jádra, kde štěpí DNA na fragmenty o 200 párech bazí a znemožňuje další expresi genů, což je vlastní podstata zániku buňky. Dalšími alternativními substráty ve výše zmíněné kaskádě jsou pro granzym B také rovnou pro-kaspáza-3 (v tomto případě granzym obchází kaspázu-8, přes kterou jinak na pro-kaspázu-3 působí nepřímo) a dle nejnovějších studií i ICAD. Uvedené skutečnosti nám napovídají, že celý princip účinku granzymu B je konstruován velice stabilně. Kaskáda dějů vedoucích k apoptóze spouštěná aktivací FAS receptoru má v podstatě tři zásadní kroky (aktivace kaspázy-8, kaspázy-3 a DFF40/CAD) a granzym B je schopen se enzymaticky účastnit každého z nich. Nepřekvapí nás tedy, že ani defekt jednoho ze zúčastněných enzymů, ani přítomnost inhibičních faktorů některé z reakcí nemusejí nutně zabránit hladkému průběhu cytotoxickými T - lymfocyty indukované apoptózy. Nespecifickým substrátem granzymu B může být také neaktivní forma takzvaného BID-proteinu který spolu s BAX a BAK náleží do rodiny proapoptotických BCL-2 bílkovin. Je to skupina bílkovin schopných inhibovat či podpořit děje vedoucí uvnitř buňky k apoptóze. Aktivovaný BID se translokuje do mitochondrií a aktivuje BAX a BAK, které se asociují s bílkovinnými komplexy tvořícími póry na membráně organely. Tím regulují permeabilitu membrány, což způsobí uvolnění cytochromu c do cytosolu. Mimo cytochromu c se z mitochondrií uvolňují i další faktory indukující apoptózu - endonukleáza G a AIF (Apoptosis Inducing Factor). Tento model je ovšem jen jedním z možných dějů, které způsobují vyplavení cytochromu c. V současnosti je přesný způsob vyloučení cytochromu c předmětem živé diskuse v odborných kruzích. Podle některých zdrojů (2) je totiž primárním důsledkem změny mitochondriální membránové propustnosti vyplavení AIF, které teprve další regulací permeability způsobí uvolnění cytochromu c. Role mitochondrií v procesech indukovaných granzymem B Granzym B podnítí uvolnění cytochromu c, endonukleázy G a AIF z mitochondrií změnou jejich membránové permeability. Cytochrom c uvolněný do cytosolu způsobuje nekrózu buňky a navíc má jednu specifickou funkci. Nekróza je způsobená jednak nedostatkem cytochromu c v mitochondrii, což naruší kontinuitu dýchacího řetězce a tudíž i jeho energetickou výtěžnost pro buňku; dále pak hromadění substrátů před nefunkčním respiračním cyklem vede k autolytickým a peroxidačně destrukčním procesům uvnitř buňky. Specifická funkce cytochromu c v kaskádě spouštějící apoptózu spočívá v jeho schopnosti aktivovat kaspázu 9 vazbou na regulační molekulu APAF1 (Apoptotic Protease-Activating Factor 1). Tato makromolekula v sobě mimo jiné zahrnuje aminokyselinové sekvence pro-kaspázy 9, které jsou vazbou cytochromu c na APAF1 a následnou změnou jeho konformace z komplexu uvolněny a aktivovány v kaspázu 9. Kaspáza 9 se zde napojuje na již výše popsanou cestu indukce apoptózy - stejně jako kaspáza 8 dokáže štěpit pro-kaspázu 3. Zodpovědnost za fragmentaci DNA však nenesou pouze kaspázy. Již zmíněná endonukleáza G je enzym nekaspázového charakteru štěpící DNA. AIF je flavoproteinový faktor** homologní s bakteriálními oxidoreduktázami, který indukuje apoptózu. Jakmile je přítomen v buněčném jádře, způsobuje kondenzaci chromatinu, přičemž tento proces nelze ovlivnit inhibitory kaspáz. Závěr Granzym B je hlavní zbraní arzenálu cytotoxických T - lymfocytů. Ty v těle dbají na pořádek a likvidují buňky nedodržující "pravidla slušného chování". Takové buňky jsou však málokdy vnímavé vůči snahám organismu je pacifikovat a ve znamení pravidla "nejlepší obranou je útok" často aktivně zasahují do mechanismů, které by mohly vést k jejich destrukci. Cytotoxická aktivita je tedy výsledkem rovnováhy mezi snahou organizmu zbavit se nebezpečných elementů na jedné straně a silnou vůlí "neposlušných" buněk přežít na straně druhé. Granzym B musí být připravený odolávat nástrahám, které ho uvnitř bránící se buňky čekají, a zároveň musí být schopen efektivní akce, což je zajištěno jeho mnohačetným a tudíž obtížně inhibičně uchopitelným mechanizmem účinku. Literatura [1]BARRY, M. & BLEACKLEY, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: All roads lead to death. Nat. Rev. Immunol . 6, volume 2, 401-409 (2002). [2] SUSIN, Santos A. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature [online] - Feb. 1999, iss. 397, [cit. 2002-11-14]. Dostupné z nature.com [nature.com/cgi-taf/DynaPage.taf file=/nature/journal/v397/n6718/abs/397441a0_fs.html&dynoptions=doi1037269796] [3] SHRESTA, S., HEUSEL, J.W., MACIVOR, DM., WESSELSCHMIDT, R.L., RUSSEL, J.H. & LEY, T.J. Granzyme B plays a critical role in cytotoxic lymphocyte-induced apoptosis. Immunol. Rev. 146, 211-221 (1995). [4] SINDELAR, Robert D. Granzyme Research Web [cit. 2002-11-14]. Dostupné z http://www.olemiss.edu [5] JANEWAY, Charles A., TRAVERS, Paul, WALPORT, Mark, SHLOMCHIK, Mark. Immunobiology: The Immune System in Health & Disease. 5th Edition [excerpts online] - 2001, part 3, [cit. 2002-11-14]. Dostupné z ncbi.nlm.nih.gov [ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi tool=bookshelf&call=bv.View..ShowSection&searchterm=caspase&rid=imm.figgrp.d1e22235]